细胞凋亡检测是生物学研究中一项重要的技术，广泛应用于疾病机理研究、药物筛选等领域。今天，我们就来详细介绍如何使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测。
实验原理
在细胞凋亡早期阶段，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）从胞质转至胞外，暴露在细胞外环境中，细胞膜通透性增加，从而被PS特异的Annexin-V探针标记。
Annexin-V为Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，对PS有极强的结合力。PI是一种经济、稳定的核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。
将Annexin V与PI联合使用时，PI被排除在活细胞和早期凋亡细胞之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性。
实验材料准备
Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒
细胞样本（悬浮细胞或贴壁细胞）
离心机
PBS
荧光显微镜或流式细胞仪
实验方法
1. 细胞收集
悬浮细胞：1000 g 离心 5 min，弃去上清。加入 1 mL 预冷的 PBS 轻轻重悬细胞沉淀，1000 g 离心 5 min，弃去上清，保留细胞沉淀。
贴壁细胞：小心吸取细胞培养液保存备用。加入 PBS 洗涤后，加入适量胰酶消化液（尽量不含 EDTA，以免影响 Annexin V 和 PS 的结合）消化细胞。加入前面收集的培养液，轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，1000 g 离心 5 min，弃去上清。加入 1 mL 预冷的 PBS 轻轻重悬细胞沉淀，1000 g 离心 5 min，弃去上清，保留细胞沉淀。 注：建议胰酶消化液不含 EDTA。
2. 重悬细胞
加入 195 μL Binding Buffer，轻轻重悬细胞，使其重悬至适宜浓度。
3. 加入染料
①加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。 Annexin V-FITC 用于检测早期凋亡细胞（磷脂酰丝氨酸外翻）。
②加入 10 μL PI Stain，轻轻混匀。 PI 用于检测晚期凋亡细胞或坏死细胞（DNA 染色）。
4. 孵育
室温下避光孵育 10-20 min，使染料与细胞充分结合。
检测与分析
流式细胞仪检测
1. 设置合适的通道检测 Annexin V-FITC 和 PI 的荧光信号。
2. 三组对照的设置非常重要，可以帮助校正背景信号和确定凋亡细胞的比例。
未染色组：用于检测自然荧光。
PI 单染组：用于确定 PI 的阳性阈值。
Annexin V-FITC 单染组：用于确定 Annexin V 的阳性阈值。
荧光显微镜检测
1. 离心后用少量 Binding Buffer 重悬细胞，涂片。
2. 在荧光显微镜下观察，通常 Annexin V-FITC 发出绿色荧光，PI 发出红色荧光。
3. 可以通过拍照或计数来定量分析凋亡细胞的比例。
注意事项
1. 整个操作过程中应尽量保持低温，以减少细胞代谢和染色过程中的自发荧光。
2. 避免长时间暴露于光线下，特别是 FITC 类染料，因为光照会导致荧光淬灭。
3. 根据实验需求调整细胞数量和染料浓度。
4. 如果使用流式细胞仪，确保仪器已校准并且通道设置正确。
结果解读
左上象限QI：通常为杂质或技术误差造成的假阳性。
右上象限Q2：晚期凋亡或坏死细胞，Annexin v和PI双阳性细胞。
右下象限Q3：早期凋亡细胞，由 Annexin ∨ 标记的单阳性细胞。
左下象限Q4：活细胞，未发生凋亡的细胞。
细胞凋亡率：Q2与Q3象限百分率的和。
